上期，我们盘点了吸收光、荧光强度、发光检测及荧光偏振检测技术。本期，笔者继续为大家盘点荧光共振能量转移、时间分辨荧光、Alpha检测等5种酶标仪检测技术。

5.荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）

  1948年，Foster首次提出荧光共振能量转移（FRET）理论，指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体(Donor)传递给受体(acceptor)的现象。

  想要实现FRET，荧光供体和受体分子必须满足以下几个前提条件：

（1）供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱须有一定程度的重叠，一般大于30%(重叠越多，FRET效果越好）；

（2）供体分子和受体分子间的距离须小于10nm（一般为7～10nm）；

（3）供体分子和受体分子的共振方向须平行或近似平行。FRET主流的荧光探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机分子和镧系元素。

典型应用：蛋白结构和构象改变、蛋白的空间分布和组装、受体/配体相互作用、核酸结构和构象改变、脂类的分布和转运、膜蛋白的研究、核酸检测等应用。

6.生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET）

  生物发光能量共振转移（BRET）检测原理与FRET类似，不同的是供体产生生物发光来激发受体荧光分子，无需激发光，背景更低，也避免了光漂白和自发荧光等问题。

  BRET于1999年首次报道，但由于使用荧光素酶导致信号强不足，因此BRET检测的灵敏度和动态范围较低。2015年，Promega公司完成了重大技术升级，将BRET技术带入了一个新的阶段：NanoBRET。与传统BRET检测相比，NanoBRET检测获得的光谱叠加更佳、信号更强且背景更低。典型应用：活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用。

7.时间分辨荧光（Time-resolved fluorescence,TRF）

  时间分辨荧光（TRF）是一种高级荧光检测技术，使用镧系金属做荧光标记（其荧光比普通荧光持续时间更长，普通荧光的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期是毫秒级。），利用荧光分子之间荧光寿命的差异来分离所需的荧光信号。与传统荧光检测方法相比，TRF具有灵敏度高、样品制备简单、检测重复性好的优点。

  常规TRF技术包括荧光寿命成像（Fluorescence Lifetime Imaging，FLIM）技术和时间分辨荧光免疫分析（Time-Resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）技术。其中TRFIA技术是将时间分辨荧光与免疫分析技术相结合，以三价镧系元素离子或其螯合物，例如铕（Eu）、铽（Tb）、钐（Sm）和镝（Dy）为标记物，来代替常用的荧光物质对抗原抗体进行标记，并使用带有时间分辨荧光检测功能的仪器（如酶标仪）来对荧光强度信号进行检测，最终绘制标准荧光曲线，定量分析待测物的浓度。

典型应用：GPCR测定、激酶测定、细胞因子和生物标志物检测、细胞代谢、蛋白质-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、药物发现、高通量筛选等。

8.均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF）

  均相时间分辨荧光（HTRF）是基于TRFIA技术衍生出的新技术，将TRF技术和FRET技术相结合，能量供体选择镧系元素铕（Eu）和铽（Tb）的穴状化合物，交联别藻蓝蛋白（cross-linked APC）或小分子荧光探针d2）作为受体，当供体和受体距离足够近时，供体被一个能量源激发，可以引发能量转移到受体，使其在特定波长发出荧光，用于检测生物分子之间的相互作用。

  检测时，通过延缓检测时间，让短寿命的荧光衰变掉后，再检测荧光强度，消除背景荧光的干扰。同时HTRF技术在均相（溶液）中一步反应，无需包被、封闭、洗涤等繁琐的操作步骤。因此该技术具有背景低、特异性好、操作简单、体系稳定等优点。典型应用：GPCRs配体结合、细胞水平的蛋白激酶实验、蛋白磷酸化、生物治疗药物研发、蛋白互作、生物因子或者趋化因子等。

9.放大化学发光亲和均相检测（AmplifiedLuminescent Proximity Homogeneous Assay Screen，AlphaScreen）

  放大化学发光亲和均相检测（AlphaScreen）是基于Ullman在1994年开发的LOCI (Luminescent Oxygen Channeling Assay)技术发展而来。简单来说，AlphaScreen是以微珠为基础的匀相发光能量转移技术。人们习惯性将AlphaScreen技术和AlphaLisa技术统称为ALPHA技术。

  AlphaScreen技术需要两个由不同的化学混合物组成的微珠，分别为供体微珠（Donor beads）和受体微珠（Acceptor beads）。其中供体微珠包含了光敏剂苯二甲蓝(Phthalocyanine)，在680nm激光的照射下，它周围环境中的氧分子转化成一种高能活跃的氧状态-单体氧(Singlet Oxygen)。单体氧可以在溶液中扩散高达200nm的距离。如果在该范围内存在受体微珠，单体氧就会触发受体微珠的二甲基噻吩衍生物，继而通过激发一系列的化学反应，最终在520-620nm产生光信号，从而达到检测目的。

  区别于AlphaScreen，AlphaLisa受体珠使用铕螯合物作为最终的荧光团，在615nm处以较窄的峰发射光。即AlphaLisa受体珠不太容易受到缓冲成分或其他吸收520-600nm光的化学物质的干扰。

典型应用：GPCR 测定、激酶测定、细胞因子定量、生物标志物检测、细胞信号传导、蛋白质-蛋白质相互作用、药物发现、高通量筛选等。

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